Jednak w późnych latach 80-tych zaawansowana laserowa mikroskopia konfokalna miała poważną wadę: apertura konfokalna nie tylko blokowała fluorescencję generowaną poza ogniskiem, ale także blokowała fluorescencję generowaną przez ognisko, która jest rozpraszana przez tkanki biologiczne, powodując spadek wydajności zbierania fluorescencji, a głębokość obrazowania nie może być większa niż 100 mikrometrów. Dlatego w latach 90. XX wieku powstała dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna łącząca laserową mikroskopię konfokalną i technologię wzbudzania dwufotonowego. Długość fali wzbudzenia procesu absorpcji dwufotonowej jest generalnie ustawiona w zakresie okna biooptycznego 680-1080 nm, co pozwala uniknąć uszkodzenia komórek lub żywych organizmów przez światło ultrafioletowe i wnika głębiej.
Obecnie najczęściej stosowanym dwufotonowym mikroskopem fluorescencyjnym jest femtosekundowy laser z tytanowymi kamieniami szlachetnymi, który jest nieporęczny i drogi, co ogranicza zastosowanie dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej w różnych dziedzinach, takich jak nauki przyrodnicze, chemia i medycyna. Dlatego w niektórych dziedzinach, takich jak diagnostyka medyczna, ludzie próbowali używać kompaktowych i niedrogich laserów na ciele stałym o czasie poniżej nanosekundy jako standardowego źródła światła.
Podstawową zasadą wzbudzenia dwufotonowego jest to, że gdy cząsteczka fluorescencyjna jest wzbudzana przy dużej gęstości fotonów, jednocześnie absorbuje dwa fotony o dużej długości fali, a następnie spontanicznie emituje fotony fluorescencyjne z powrotem do stanu podstawowego po skokach wzbudzenia i procesach relaksacji. W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią fluorescencyjną z wzbudzeniem pojedynczym fotonem, generowanie sygnału optycznego w mikroskopii fluorescencyjnej z wzbudzeniem dwufotonowym jest nieliniowe, przy czym światło wzbudzające jest źródłem światła o większej długości fali i wyższej mocy szczytowej, a emitowane fotony fluorescencyjne mają długość fali nieco dłuższy niż połowa długości fali wzbudzenia.
Dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna wykorzystuje laserowe źródło światła bliskiej podczerwieni, a jej nieliniowy charakter nie wymaga apertury konfokalnej. Dlatego w porównaniu z mikroskopią konfokalną dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna ma następujące zalety:
- Duża głębokość obrazowania i niskie uszkodzenia optyczne;
- Nie jest wymagana apertura konfokalna, a wydajność zbierania fluorescencji jest znacznie poprawiona;
- Wyższa rozdzielczość przestrzenna i kontrast;
- Mały zakres wzbudzenia, mała fototoksyczność i bielenie;
- Długości fal emisji i wzbudzenia są daleko od siebie, co pozwala uniknąć nakładania się widm;
